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细胞培养常见问题及其解决方法
合肥博美生物科技有限责任公司 / 2015-03-02

 

                                                                                         细胞培养常见问题及其解决方法
 
1.如何选用特殊细胞系培养基? 
培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之,首选MEM做粘附
9. 悬浮性细胞应如何继代处理?  
一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中, 稀释细胞浓度即可, 若培养液太多时, 可将培养角瓶口端稍微抬高, 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶, 加入新鲜培养基稀释至适当浓度, 重复前述步骤即可。 
10.冷冻管应如何解冻?  
取出冷冻管后, 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻, 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化, 并注意水面不可超过冷冻管盖沿, 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时, 必须注意安全, 预防冷冻管之爆裂。 
11. 细胞冷冻管解冻培养时, 是否应马上去除DMSO?  
除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外, 绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞), 在解冻之后, 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中, 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可, 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 
12。 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度?应如何处理?  
一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0。05% trypsin-0。53mMEDTA。4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中, 保存于–20 °C,避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低, 并可减少污染之机会。  
13。欲将一般动物细胞离心下来,其离心速率应为多少转速?  
欲回收动物细胞, 其离心速率一般为300xg (约1,000rpm),5 - 10 分钟, 过高之转速, 将造成细胞死亡。  
14. 细胞冷冻培养基之成份为何?  
动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意:由于DMSO 稀释时会放出大量热能, 故不可将DMSO 直接加入细胞液中, 必须使用前先行配制完成。  
15。DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何?  
冷冻保存使用之DMSO 等级, 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650), 其本身即为无菌状况, 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中, 保存于4°C, 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质, 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO, 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。  
16。冷冻保存细胞之方法?  
冷冻保存方法一: 冷冻管置于4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*) → -80 °C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。 
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 °C 至–80 °C 以下, 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 °C 不可超过1 小时, 以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微 降低一些。  
17. 细胞欲冷冻保存时, 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度?  
冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial, 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。
18.培养基中是否须添加抗生素?  
除于特殊筛选系统中外, 一般正常培养状态下, 培养基中不应添加任何抗生素。 
19。应如何避免细胞污染?  
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。  
20.如果细胞发生微生物污染时,应如何处理?  
原则上:直接灭菌后丢弃之。  
当重要的培养污染时,研究者可能试图消除或控制污染。首先,确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母,把污染细胞与其它细胞系隔离开,用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台,检查HEPA过滤器。 
高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性,因而,做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。 
1。在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞,稀释到常规细胞传代的浓度。 
2.分散细胞悬液到多孔培养板中,或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内,把选择抗生素加入到每一个孔中。例如,两性霉素B推荐下列浓度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。 
3.每天观测细胞毒性指标,如脱落,出现空泡,汇合度下降和变圆。 
4.确定抗生素毒性水平后,使用低于毒性浓度2~3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2~3代。 
5.在无抗生素的培养基中培养细胞一代。 
6.重复步骤4。 
7。在无抗生素的培养基中培养4~6代,确定污染是否以已被消除。 
21.支原体(mycoplasma) 污染的细胞, 是否能以肉眼观察出异状?  
不能。除极有经验之专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株, 无法以其外观分辨之。  
22.支原体污染会对
24. CO2 培养箱之水盘如何保持清洁?  
定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。  
25.为何培养基保存于4 °C 冰箱中, 颜色会偏暗红色, 且pH值会越来越偏碱性?  
培养基保存于4 °C 冰箱中, 培养基内之CO2 会逐渐溢出,造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果, 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时, 可以通入无菌过滤之CO2, 以调整pH 值。  
26. 各种
31.GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定?  
GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物,其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽,释放L-谷氨酰胺供利用。 
GlutaMAX-I二肽非常稳定,即使在121磅灭菌20分钟,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同条件下,L-谷氨酰胺几乎完全降解。 
32.什么培养基中可以省去加酚红?  
酚红在培养基中用作PH值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用,(特别是雌激素)。为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基。 
33。如何用台盼兰计数活细胞?  
用无血清培养基把细胞悬液稀释到200~2000个/毫升,在0.1毫升细胞悬液中加0.1毫升0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀,数分钟后,用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰,因而染成蓝色细胞是死细胞。 
34。培养基中丙酮酸钠的作用是什么?  
丙酮酸钠可以作为

4°C 
25°C 
37°C 
8。1
8.2
8.3
8.4
8.5
8。6
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8.9
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37.如何从T25瓶中转移sf9细胞?能用胰蛋白酶消化吗? 
我们推荐使用脱落细胞的方法,此技术破坏性最小,生活力最高。通过使用巴斯德吸液管,让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下,才使用胰酶消化细胞。 
38。胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞: 
1. 去除培养基。 
2。 用2ml 1xPBS(足以覆盖细胞表面)洗涤细胞,去除PBS。 
3. 加入2ml 1x胰酶EDTA(恰好覆盖细胞表面)。 
4。 37 孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。 
5. 向细胞中加入2ml 
44. 培养基中添加了血清和抗生素后,可长期保存吗? 
一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。 
45。培养基及其它添加物和试剂可反复冻融吗? 
大部分添加物和试剂最多可以冻融3次,如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,将会影响它的性能。 
46。为什么要在溶解的一周内使用贮存在4冰箱中的液体胰蛋白酶溶液? 
胰蛋白酶在4就可能开始降解,如果在室温下放置超过30分钟,就会变得不稳定。 
47。保存血清最好的方法? 
我们建议血清应保存在-5至-2O。若存放于4时,请勿超过一个月。若一次无法用完一瓶,建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内,再放回冷冻。 
48. 如何解冻血清才不会使产品质量受损? 
将血清从冷冻箱取出后,先置于2~8冰箱使之融解,然后在室温下使之全融。但必须注意的是,融解过程中必须规则地摇晃均匀。 
49. 血清解冻后发现有絮状沉淀物出现,该如何处理? 
血清中沉淀物的出现有许多种原因,但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成,而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后,也会存在于血清中,亦是造成沉淀物的原因之一。但这些絮状沉淀物,并不影响血清本身的质量。 
若欲去除这些絮状沉淀物,可以将血清分装至无菌离心管内,以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物,因为它可能会阻塞过滤膜。
50。 为什么要热灭活血清? 
加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件,刺激平滑肌收缩,细胞和血小板释放组胺,激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究,培养ES细胞、平滑肌细胞时,推荐使用热灭活血清。 
51。 有必要做热灭活吗? 
实验显示,经过正确处理的热灭活血清,对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进,或完全没有任何作用,甚至通常因为高温处理影响了血清的质量,而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清,沉淀物的形成会显著的增多,这些沉淀物在倒置显微镜下观察,像是“小黑点”,常常会让研究者误以为是血清遭受污染,而把血清放在37环境中,又会使此沉淀物更增多,使研究者误认为是微生物的分裂扩增。 
若非必须,可以不需要做热处理这一步。不但节省时间,更确保血清的质量! 
52. 为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀? 
有些胎牛血清产品没有预老化,储存在2-8时,血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在-20储存胎牛血清,避免反复冻融。 
53. 如何避免沉淀物的产生? 
我们建议您在使用血清的时候,注意下列的操作: 
(1)解冻血清时,请按照所建议的逐步解冻法(-20至4至室温),若血清解冻时改变的温度太大(如-20至37),非常容易产生沉淀物。 
(2)解冻血清时,请随时将之摇晃均匀,使温度及成分均一,减少沉淀的发生。 
(3)请勿将血清置于37太久。若在37放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害,而影响血清的质量。 
(4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以无须做此步骤。 
(5)若必须做血清的热灭活,请遵守56,30分钟的原则,并且随时摇晃均匀。温度过高,时间过久或摇晃不均匀,都会造成沉淀物的增多。
                            细胞培养常见问题解答(FAQ)
1 冷冻管应如何解冻? 
取出冷冻管后, 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻, 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化, 并注意水面不可超过冷冻管盖沿, 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时, 必须注意安全, 预防冷冻管之爆裂。 
2 细胞冷冻管解冻培养时, 是否应马上去除DMSO? 
除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外, 绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞), 在解冻之后, 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中, 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可, 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 
3 可否使用与原先培养条件不同之培养基? 
不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之
9 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度?应如何处理? 
一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中, 保存于–20 °C,避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低, 并可减少污染之机会。 
10 悬浮性细胞应如何继代处理? 
一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中, 稀释细胞浓度即可, 若培养液太多时, 可将培养角瓶口端稍微抬高, 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶, 加入新鲜培养基稀释至适当浓度, 重复前述步骤即可。 
11 欲将一般动物细胞离心下来,其离心速率应为多少转速? 
欲回收动物细胞, 其离心速率一般为300xg (约1,000rpm),5 - 10 分钟, 过高之转速, 将造成细胞死亡。 
12 细胞之接种密度为何? 
依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。 
13 细胞冷冻培养基之成份为何? 
动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意:由于DMSO 稀释时会放出大量热能, 故不可将DMSO 直接加入细胞液中, 必须使用前先行配制完成。 
14 DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何? 
冷冻保存使用之DMSO 等级, 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650), 其本身即为无菌状况, 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中, 保存于4°C, 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质, 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO, 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。 
15 冷冻保存细胞之方法? 
冷冻保存方法一: 冷冻管置于4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*) → -80 °C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。 
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 °C 至–80 °C 以下, 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 °C 不可超过1 小时, 以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微 
降低一些。 
16 细胞欲冷冻保存时, 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度? 
冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial, 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。 
17 应如何避免细胞污染? 
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。 
18 如果细胞发生微生物污染时,应如何处理? 
直接灭菌后丢弃之。
19 支原体(mycoplasma) 污染的细胞, 是否能以肉眼观察出异状? 
不能。除极有经验之专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株, 
无法以其外观分辨之。 
20 支原体污染会对
细胞培养常见问题及解答 
1.如何选用培养基?
    培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之,首选MEM做粘附
3.L-谷氨酰胺在
4。GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定? 
    GlutaMAX-I二肽是L-谷氨酰胺的衍生物,将其不稳定的α-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽,释放L-谷氨酰胺供利用。
    GlutaMAX-I二肽非常稳定,即使在121磅灭菌20分钟,GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解,如果在相同条件下,L-谷氨酰胺几乎完全降解。
5.为什么培养基中可以省去加酚红? 
    酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用(特别是雌激素)。为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基。
6.如何用台盼兰计数活细胞? 
    用无血清培养基把细胞悬液稀释到200-2000个/毫升,在0。1毫升的细胞中加入0。1毫升的0。4%的台盼兰溶液。轻轻混匀,数分钟后,用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰,因而染成蓝色的细胞是死细胞。
7。如何消除组织培养的污染?
    当重要的培养污染时,研究者可能试图消除或控制污染。首先,确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母,把污染细胞与其它细胞系隔离开,用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台,检查HEPA过滤器。
    高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性,因而,做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
1)在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞,稀释到常规细胞传代的浓度。
2)分散细胞悬液到多孔培养板中,或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内,把选择抗生素加入到每一个孔中。例如,两性霉素B推荐下列浓度,0。25,0。50,1。0,2。0,4。0,8。0 mg/ml。
3)每天观测细胞毒性指标,如脱落,出现空泡,汇合度下降和变圆。
4)确定抗生素毒性水平后,使用低于毒性浓度2-3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2-3代。
5)在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
6)重复步骤4。
7)在无抗生素的培养基中培养4-6代,确定污染是否以已被消除。
8.培养基中丙酮酸钠的作用是什么?
    丙酮酸钠可以作为
9。Hank’s 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用,不需要CO2培养箱。原因是什么?Hank’s 平衡盐溶液(HBS)和Earle’s平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别? 
    HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,碳酸氢钠的含量在Eagles (2。2g/L)中比在Hanks (0。35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡,以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中,溶液会变碱,Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织,需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在
10.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差别?
    Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清执行的所有的标准检验程序,而且除了这些标准检测,Certified胎牛血清还有如下一些附加的检测:
End-Point Determination of Endotoxin Content
噬菌体检验
生物化学检测 
激素的检测
血红蛋白检测
Sf9 细胞生长促进及方法学检测
11。二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么? 
    二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前,用EDTA清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子。
12.制备 lipid-DNA的方法会影响转染效率吗? 
    是的。对于LIPOFECTAMlNE Reagent,稀释试剂在100μl OPTI-MEM中,稀释DNA在100μl OPTI-MEM中。混合两种溶液在室温下孵育15分钟。对于LIPOFECTIN Reagent,在加入DNA溶液前允许稀释的试剂和培养基孵育至少30分钟可以增加3倍的效率。确保复合物在没有血清的情况下形成。孵育15分钟后,在复合物中加入含有血清的培养基(800μl)。(注意以上是35mm培养皿使用体积)。对于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA应该在与脂质体混合之前首先与Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步骤允许在一个很小的体积下混合DNA和脂质体,接下来可以不需要换培养基的情况下直接加入。
13。我使用SF900 时,细胞生长良好,但是为什么我的蛋白产物不如使用Graces 液和10%胎牛血清时效果好? 
    如果目的蛋白是一个后期蛋白,它将与蛋白酶一起表达,这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。在加有血清的培养基中,这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白,从而使目的蛋白产品保持完好。在无血清配方中,蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。为了避免这一问题,加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清(少于1%),让血清给蛋白酶提供作用底物。 
14.如何检测内毒素(热源)水平? 
    LAL(Limulus Amebocyte Lysate)试验是可用的最敏感和特异的检测细菌内毒素的方法。Levin和Bang 发现细菌可引起鲎(Limulus polyphemus)血管内的凝集作用。内毒素启动一个细胞内酶原系统(丝氨酸蛋白酶级联反应系统),通过修饰凝集素,产生一种透明的胶,LAL中的凝固蛋白,从而,形成不可溶的基质。LAL试剂缓冲的鲎(血细胞)裂解物。
胎牛血清的内毒素检测是在Grand Island,按照手册上Gel-clot 方法进行的。在对血清产品进行内毒素检测前,用无热源的水1:10稀释样品。稀释样品沸水育5分钟,以消除抑制剂。(通常,血液中的内毒素结合成份的出现会抑制凝胶过程,使内毒素不能与LAL反应。样品预先热处理可以消除这种抑制作用。) 
15。我可以使用固体形式的Murashige Skog 培养基吗? 
    如果使用固体形式的培养基,需要加入琼脂。琼脂加入前要先灭菌。应该避免MS培养基的直接灭菌,应该高压灭菌琼脂溶液,然后把融化的琼脂溶液加入到MS培养基中。
16. 20下配制的缓冲液,在较高或较低的温度下PH值会改变吗?
    对于普通使用的缓冲液,PH值随温度变化而变化。
下表列出温度改变10时,PH值的变化情况
例如 20下配制PH7。4 Tris缓冲液,40时PH值为 7.4-(2x0.310)=6.78
17. 室温下(25)配制的Tris-HCl溶液,在37使用时PH值是多少?
    缓冲液的PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4,25,37时,不同的PH值。
18. 昆虫
19。 High Five细胞有任何其它名称吗?
    High Five细胞也被称为Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。
20。在High Five无血清培养基中去污剂的浓度是多少? 
    High Five无血清培养基中去污剂的浓度:0.025 g/L Tween-80,1.0 g/L Pluronic Poly-all。 
21.High Five细胞用多大的密度冻存? 
    3。0x10E6 cells/ml 
22.在我的果蝇培养基中发现形成白色沉淀,加热后溶解。它是什么?对我的细胞有害吗? 
    可能是谷氨酰胺沉淀,但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培养基中谷氨酰胺的浓度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的浓度比在RPMI 1640中高25倍,而且比谷氨酰胺更加难以溶解。沉淀也可能是不止一种成分的复合物。它可能是由于贮存在局部温度较低的地方引起。只要沉淀在培养条件下可以溶解,对实验不会有不利的影响。 
23.如何从T25瓶中转移sf9细胞?能用胰蛋白酶消化吗? 
    我们强力推荐使用脱落细胞的方法,因为这项技术破坏性最小,生活力最高。通过使用巴氏德吸液管,让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下,才使用胰酶消化细胞。
胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞:
1)去除培养基。
2) 用2ml 1xPBS(足以覆盖细胞表面)洗涤细胞,去除PBS.
3) 加入2ml 1x胰酶EDTA(恰好覆盖细胞表面)。
4) 37 孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。
5) 向细胞中加入2ml 
24。在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时,肝素的使用量是多少? 
    为了防止悬浮培养细胞聚集的形成,使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。 
25.如何评估ES细胞合格的胎牛血清? 
    使用D3 ES细胞。这是一个对于胎牛血清中生长促进、生长抑制和分化因子非常敏感的细胞系。
相关生长效率分析:
    当ES细胞以非常低的密度传入包含10%胎牛血清的生长培养基中,检测开始和支持ES细胞
26.在重新冻存sf9细胞前,它可以传多少代?随着传代的次数的增加,它的感染能力会降低吗? 
    通常情况当细胞经过30次传代后,应该返回冻存。无论什么时候记数时,都应该检查细胞活力。如果超过95%的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍,细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降,它们的感染力将不在是有效的。
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